DESAIN PRIMER GEN PENGKODE RNA DEPENDENT RNA POLIMERASE (RdRp) UNTUK DETEKSI SARS COV2 DENGAN MENGGUNAKAN REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION
Abstrak
Virus Corona atau severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) adalah virus yang menyerang sistem pernapasan. Penyakit karena infeksi virus ini disebut Corona Virus Desease 19 (COVID-19). Infeksi karena SARS-CoV-2 dinyatakan oleh World Health Organization (WHO) sebagai pandemi. Deteksi adanya infeksi karena SARS COV2 dilakukan dengan menggunakan Real Time Polymerase Chain Reaction dengan mendeteksi urutan RNA virus sebagai gold standarnya. Gen virus yang ditargetkan salah satunya adalah RNA-dependent RNA polymerase (RdRp). Deteksi dengan menggunakan PCR terdiri dari tahap isolasi asam nukleat, amplifikasi DNA menggunakan qPCR dan pembacaan kurva amplifikasi. Pemeriksaan SARS-COV2 dengan menggunakan teknik molekuler menggunakan beberapa reagen yang sudah direkomendasikan oleh WHO. Reagen-reagen tersebut bersifat khusus dan close system dimana komponen reagen master mix nya sudah dicampurkan dengan primer sehingga tidak dapat menggunakan reagen pada umumnya. Primer merupakan komponen penting dalam sistem pendeteksian secara molekuler. Primer berfungsi sebagai pembatas dari fragmen DNA target yang akan diamplifikasi. Setiap satu fragmen target, memerlukan sepasang primer yang sesuai dengan DNA target. Primer ini perlu di desain untuk mencapai tingkat keberhasilan yang tinggi dalam deteksi SARS-COV2. Desain primer secara in silico akan memudahkan dalam memperoleh primer yang baik untuk proses amplifikasi fragmen gen. Berdasarkan hasil penelitian diperoleh urutan primer forward adalah ACCGTAGCTGGTGTCTCTAT dan urutan primer reverse adalah GTGCCAACCACCATAGAATTTG. Selanjutnya dilakukan proses deteksi secara in vitro untuk menguji keberhasilan primer dalam membentuk produk yang diinginkan. Berdasarkan hasil penelitian primer tersebut dapat menempel pada DNA template dibuktikan dengan terbentuknya kurva amplifikasi dengan nilai CT 21.627 dengan kondisi PCR optimal melalui tahapan: Reverse transcription pada suhu 37°C, 15 menit, 1 siklus, Inaktivasi Reverse transcriptase dan Aktivasi DNA Polimerase pada suhu 95°C selama 10 menit, 1 siklus, Denaturasi pada suhu 95°C selama 10 detik, 40 siklus, annealing pada suhu 560C selama 10 detik 40 siklus. Dilanjutkan tahap ekstensi pada suhu 720C selama30 detik 1 siklus
Artikel teks lengkap
Referensi
Prastyowati, A. (2020). Mengenal Karakteristik Virus SARS-CoV-2 Penyebab Penyakit COVID-19 Sebagai Dasar Upaya Untuk Pengembangan Obat Antivirus Dan Vaksin. 11(1).
Rosenblum, M. D., Way, S. S. & Abbas, A. K. (2015). Regulatory T cell memory. Nat Publ Gr 1–12. Nature Publishing Group.
Alves, N., Zauli, G., Lisandre, C., Menezes, P. D., Lommez, C., Oliveira, D., . . . Ferreira, S. D. (2016). Genetics and Molecular Microbiology
Abbas, N., Rasool, M. and Afroze, T. (2005) ‘PCR based diagnosis of hepatitis B virus’, Pakistan Journal of Zoology, 37(4), pp. 285–288.
Hartanti, M. D. (2020). Real-Time Polymerase Chain Reaction for detecting SARS-COV2 in Indonesia: Are the results reliable? Universa Medicina, 39(2), 71. https://doi.org/10.18051/univmed.2020.v39.71-73
Viljoen et al. (2015) Molecular Diagnostic PCR Handbook. Dordrecht: Springer
Kim, J., Lim, J. and Lee, C. (2013) ‘Quantitative real-time PCR approaches for microbial community studies in wastewater treatment systems: Applications and considerations’, Biotechnology Advances. Elsevier Inc., 31(8), pp. 1358–1373. doi: 10.1016/j.biotechadv.2013.05.010
Chook, J. B. et al. (2015) ‘Universal Primers for Detection and Sequencing of Hepatitis B Virus Genomes across Genotypes A to G’, Journal of Clinical Microbiology, 53(6).
Nurhayati, B. and Darmawati, S. (2017) Biologi Sel dan Molekuler. 1st edn. Jakarta: Kementrian Kesehatan Republik Indonesia
Yano, Y. et al. (2015) ‘Hepatitis B virus infection in Indonesia’, World Journal of Gastroenterology, 21(38), pp. 10714–10720. doi: 10.3748/wjg.v21.i38.10714.
Blirt (2016) PCR Optimization and Troubleshooting. Available at: http://www.dnagdansk.com/media/Downloads/pcr-optimization-and-trouble shooting.pdf.
Thermofisher Scientific (2016) PCR Cycling Parameters–Six Key Considerations for Success, Thermofisher Scientific. Available at: https://www.thermofisher.com/ id/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecularbiology/pcr-education/pcr-reagents-enzymes/pcr-cycling-considerations.html#Annealing.
Olioso, D. et al. (2007) ‘Detection and quantification of hepatitis B virus DNA by SYBR green real-time polymerase chain reaction’, European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 26(1), pp. 43–50. doi: 10.1007/s10096-006-0223-y.
Liu, S. Y. et al. (2011) ‘Three-dimensional structure of the hepatitis B core antigen particle truncated at residue 154’, Science China Life Sciences, 54(2), pp. 171–174. doi: 10.1007/s11427-010-4098-x.
Gunson, R., Gillespie, G. and Carman, W. F. (2003) ‘Optimisation of PCR reactions using primer chessboarding’, Journal of Clinical Virology, 26(3), pp. 369–373. doi: 10.1016/S1386-6532(03)00006-4.
Behlke, M. A., Jäger, K. B. and Brown, T. (2019) Polymerase Chain Reaction: Theory and Technology. Caister Academic Press. doi: https://doi.org/10.21775 /9781912530243.
Lu, R., Zhao, X., Li, J., Niu, P., Yang, B., Wu, H., Wang, W., Song, H., Huang, B., Zhu, N., Bi, Y., Ma, X., Zhan, F., Wang, L., Hu, T., Zhou, H., Hu, Z., Zhou, W., Zhao, L., … Tan, W. (2020). Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. In The Lancet (Vol. 395, Issue 10224, pp. 565–574). https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30251-8
Wang, M., Zhao, R., Gao, L., Gao, X., Wang, D., & Gallagher, T. (2020). SARS-CoV-2 : Structure , Biology , and Structure-Based Therapeutics Development. 10(November), 1– 17. https://doi.org/10.3389/fcimb.2020.587269
Tan, S. C., & Yiap, B. C. (2009). DNA, RNA, and protein extraction: The past and the present. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2009. https://doi.org/10.1155/2009/574398
Kalendar, R., Lee, D. and Schulman, A. H. (2014) ‘FastPCR Software for PCR, In Silico PCR, and Oligonucleotide Assembly and Analysis’, p. 271.
Ehtisham, M. et al. (2016) ‘Polymerase Chain Reaction (PCR): Back to Basics’, Indian Journal of Contemporary Dentistry, 4(2), p. 30. doi: 10.5958/2320-5962. 2016.00030.9.
Stephenson, F. H. and Abilock, M. C. (2012) ‘PCR Optimization Table of Contents Fall 2012 Optimizing the Polymerase Chain Reaction’, Babec
Bergkvist, A. et al. (2012) A Technical Guide PCR Technologies. Edited by T. Nolan. Sigma-Aldrich. Available at: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/ sigmaaldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/pcr-technologies-guide.pdf
Lorenz, T. C. (2012) ‘Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies’, Journal of Visualized Experiments, (63), pp. 1–15. doi: 10.3791/3998.
Joshi, M. and Deshpande, J. D. (2011) ‘Polymerase Chain Reaction: Methods, Principles and Application’, International Journal of Biomedical Research, 2(1). doi: 10.7439/ijbr.v2i1.83.
Tahamtan, A., & Ardebili, A. (2020). Real-time RT-PCR in COVID-19 detection: issues affecting the results. Expert Review of Molecular Diagnostics, 20(5), 453–454. https://doi.org/10.1080/14737159.2020.1757437
Kim, N., Kwon, A., Roh, E. Y., Yoon, J. H., Han, M. S., Park, S.-W., Park, H., & Shin, S. (2020). Effects of Storage Temperature and Media/Buffer for SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection. American Journal of Clinical Pathology, 280–285. https://doi.org/10.1093/ajcp/aqaa207
Widayat, W., Winarni Agustini, T., Suzery, M., Ni’matullah Al-Baarri, A., & Rahmi Putri, S. (2019). Real Time-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) sebagai Alat Deteksi DNA Babi dalam Beberapa Produk Non-Pangan. Indonesia Journal of Halal, 2(1), 26. https://doi.org/10.14710/halal.v2i1.5361
Qiagen (2013) How is ‘Touchdown PCR’ used to increase PCR specificity? Available at: https://www.qiagen.com/us/resources/faq?id=0ffb80ac-7470-4955-93c9- ce455869cb4b&lang=en (Accessed: 15 July 2020)
Kim, J., Lim, J. and Lee, C. (2013) ‘Quantitative real-time PCR approaches for microbial community studies in wastewater treatment systems: Applications and considerations’, Biotechnology Advances. Elsevier Inc., 31(8), pp. 1358–1373. doi: 10.1016/j.biotechadv.2013.05.010
Promega (2014a) DNA Purification (The basics of DNA isolation, plasmid growth and DNA Quantification), Promega. Available at: https://worldwide .promega.com/resources/guides/nucleic-acid-analysis/dna-purification/ (Accessed: 26 December 2019)
Ruddock, C. A. (2016) ‘Polymerase Chain Reaction (PCR)’, Wiley Encyclopedia of Forensic Science, pp. 1–4. doi: 10.1002/9780470061589.fsa1029.pub2.
Bio-Rad laboratories (2006) ‘Real-Time PCR Applications Guide’, Methods, pp. 2–85
Xiaowei, W. and Seed, B. (2006) ‘High-troughput primer and probe design’, in Real-Time PCR. New York: Taylor and Francis Grou
Penulis
Artikel ini berlisensi Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.